Genes and Coffee

mayo 10, 2008

Sábado at the bench

Filed under: Laboratorio-Laboratory — Sergio @ 3:01 pm

Pensaba iniciar el post de esta semana desarrollando el descubrimiento por parte de un grupo sueco del Karolinska Institute. Más o menos vienen a decir que, una vez que se predetermina el número de células grasas en el cuerpo (adipocitos), éste se mantiene constante.  Lo que explicaría el porque es tan fácil recuperar el peso perdido…

Pero, sinceramente, no he tenido el tiempo necesario para leerme más que el abstract del artículo, así que, ahí queda la idea, y el que quiera saber más, seguramente podrá acudir a una de las numerosas reseñas que sobre este artículo circulan por la red.

Y como me había quedado sin entrada para esta semana, os voy a contar por qué estoy hoy, un sábado, en el laboratorio.  El culpable de mi desdicha se llama clonaje molecular (molecular cloning). Estoy en la cuenta atrás de la tesis, y el tiempo es oro. Y el clonaje es uno de los procedimientos, desde mi punto de vista, que puede hacerse más tedioso y largo. Básicamente consiste en amplificar una región de DNA que sea de tu interés, pongamos un gen. Esto se suele hacer usando la técnica de la PCR, usando un cDNA como molde.  Para amplificar ese gen y poder trabajar con él posteriormente, se construyen unos primers o cebadores, que son unas pequeños trozos de DNA que complementan a nuestro gen de interés, es decir, que son específicos para ese gen en concreto -o, al menos, eso sería lo deseable-. A esos primers se les puede añadir otra pequeña secuencia de DNA llamada diana de restricción. De esta manera, con esos cebadores, amplificaremos nuestro gen de interés que además llevará unas secuencias extra de DNA -las dianas de restricción- que serán últiles a la hora de clonar esos fragmentos de DNA.

Una vez que tienes la PCR, hay que ver que ha funcionado. Básicamente consiste en correr la preparación en un gel de agarosa, y teñir el mismo usando una solución de Bromuro de Etidio (un agente intercalante que, bajo la luz ultravioleta, brilla, permitiendo la identificación visual del DNA que esté dentro del gel. Aviso a navegantes, al ser el Bromuro de Etidio un agente que se intercala en el DNA, es altamente mutagénico, por lo que es conveniente manejarlo con cuidado, en las áreas especialmente habilitadas para ello y utilizando las medidas de seguridad obligadas).

Bueno, entonces, ya tenemos nuestro gen de interés… y lo mejor es que ahora posee en los extremos una secuencia bastante única, la diana de restricción.  Algunos se habrán dado cuenta de que si hemos hecho las cosas bien, y la suerte ha estado con nosotros, tenemos el gen que queremos amplificado (gracias a la PCR) y con dianas de restricción a los extremos, pero todo eso lo tenemos dentro de un gel. Lo bueno de mi laboratorio es que a todos nos encantan los kits y, como de momento hay dinero, para solventar este problema uso un kit que sirve para extraer el DNA de la agarosa. Así que, primero corto la banda del gel que contiene mi gen (ahora, además de trabajar con un gel que contiene bromuro de etidio, debemos de trabajar con luz ultravioleta -la necesitamos para saber dónde está nuestro DNA-, así que, además utilizaremos una máscara protectora. Con una cuchilla cortamos la banda, la introducimos en un tubito tipo eppendorf (esos tubitos pequeños, de 1.5 ml de capacidad que salen en la popular serie C.S.I.) y con el kit, en un rato, tenemos el DNA disuelto en agua (o en un buffer, eso va en gustos).  Una vez que tenemos esta solución, yo personalmente suelo cortar ese DNA utilizando las enzimas de restricción apropiadas, es decir, aquellas que reconocen las sequencias de restricción que hemos introducido en los extremos de nuestro gen. Al mismo tiempo, elegimos un vector apropiado para acoger nuestro gen. Hay infinidad de vectores hoy en día, de distintos tipos: plásmidos, fagos, cromosomas artificiales de bacteria (BACs), etc, etc… nosotros solemos trabajar con plásmidos. Un plásmido es una sequencia de DNA circular, normalmente hoy en día son artificiales, que llevan un Origen de Replicación -una sequencia que permite que al plásmido replicarse cuando se introduce en un organismo apropiado, por ejemplo, una bacteria-, un promotor, que será el encargado de reclutar la maquinaria celular necesaria para expresar nuestro gen de interés, y algún otro que tenga el plásmido, como los genes reporteros (reporter genes). Estos últimos pueden expresar proteínas que hacen que podamos ver las células que tienen el plásmido (por ejemplo GFP, conocida como proteína verde fluorescente), u otros genes que otorgan resistencia a antibióticos (de esta manera, se pueden seleccionar bacterias y/o células que sobrevivan en un medio con un antibiótico dado, pues esos organismos serán los portadores de nuestro plásmido, al ser éste el que otorga la resistencia).

Los plásmidos también poseen una zona rica en dianas de restricción, de esta manera será en esta zona donde podamos insertar nuestro gen de interés (para clonar un gen con las dianas 1 y 2, debemos de contar con un plásmido que esté cortado con las enzimas que reconocen 1 y 2). Una vez que disponemos de nuestro vector cortado (ahora está preparado para recibir a nuestro gen), los juntamos, y con ayuda de una Ligasa (por ejemplo, T4 ligase) uniremos ambos fragmentos. Así tendremos un plásmido circular, que expresa nuestro gen.

Obviamente, no todos los trozos se unen correctamente, es por esto que tras hacer esto, ponemos un poco de esta mezcla de ligación en contacto con unas bacterias, preparadas para absorber el plásmido. Un rato después, algunas de esas bacterias habrán acogido el plásmido, el cual estará en su interior. Si ponemos estas bacterias a crecer en un medio selectivo, de tal forma que solo las que tengan el plásmido puedan crecer,  obtendremos una población de bacterias que llevan nuestro plásmido. Eso es lo que hacemos, ponemos esas bacterias a crecer en una placa petri con LB agar, un medio sólido con los nutrientes que necesitan las bacterias para crecer, pero les ponemos una trampa, y es que añadimos un antibiótico. Ninguna bacteria puede crecer en este medio, a menos que contenga uno de nuestros plásmidos en perfecto estado, expresando un gen de resistencia al antibiótico que hay en la placa. Así, tras unas 12 horas a 37ºC, tendremos una placa con algunas – pocas o muchas, depende de muchos factores- colonias. Esas colonias vienen de una sola bacteria, es decir, es un cultivo clonal. Lo que sigue es fácil de imaginar… nos aseguramos de que esas colonias expresan realmente nuestro plásmido, asegurándonos igualmente de que el plásmido lleva nuestro gen (esto se puede hacer por PCR, mediante una técnica llamada comunmente colony PCR… que consiste en utilizar a las bacterias como fuente de DNA, utilizando un primer que complemente al plásmido y otro que complemente al gen que hemos clonado. Esto es lo ideal, si no, se pueden usar dos primers del gen o del plásmido).

Una vez que tenemos nuestra/s conolina/s positiva, la queremos amplificar. Para esto ponemos esa colonia a crecer en LB, pero esta vez líquido, manteniendo el antibiótico para seleccionar nuestra colonia. De esta manera tendremos una  gran cantidad de plásmido, pudiéndolo usar para otros propósitos: producción de proteína (la que codifica nuestro gen), producción de plásmido para transfectar células (produciríamos nuestra proteína en células), etc.

Bueno, y ahora, me toca marcharme del laboratorio. Decir que ha salido uno de los experimentos que he venido a hacer, así que estoy muy contento!!

Esta noche o mañana, repasaré el post, porque habiéndolo escrito entre los ratos libres que me dejaba un western y un cloning, seguro que tiene decenas de errores…

Saludos,

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